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ChIP-seq
ChIP-seq

一、产品概述

1.1 什么是ChIP-seq 

ChIP-seq技术结合染色质免疫共沉淀技术(Chromatin ImmunoprecipitationChIP)与高通量测序,是研究体内蛋白质与DNA相互作用的有力工具,通常用于转录因子结合位点或组蛋白特异性修饰位点的研究。

1.2 产品功能

ChIP-seq技术是将ChIP与高通量二代测序结合,从基因组范围内检测组蛋白、转录因子等蛋白质结合的DNA区段。研究转录因子及其他与染色质相关的蛋白如何影响表观调控,检测在一些生物过程与疾病中,DNA与蛋白质相互作用调控基因表达的重要性。结合生物信息学分析,能够找到转录因子下游调控的靶基因,为进一步阐明生物学机制提供依据。      

1.3 技术优势 

1. 全基因组覆盖:ChIP-Seq可在全基因组范围单碱基水平对蛋白结合位点进行筛选与鉴定。

2. 高灵敏度:每个样本可获得数百万条的序列标签,可发现研究基因组上稀有的蛋白结合位点。

3. 高精确率:可获得高水平的信噪比数据,准确区分真实事件与噪音,精确定位蛋白结合位点。

       
1.4 实验简介 

1.4.1实验原理     

 首先通过染色质免疫共沉淀技术(ChIP)特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,并对其进行纯化与文库构建;然后对富集得到的DNA片段进行高通量测序。
      
 应用:(1)判断DNA链的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰;

     (2)检测RNA polymerase II及其它反式因子在基因组上结合位点的精确定位;

     (3)研究组蛋白共价修饰与基因表达的关系;

     (4CTCF转录因子研究。        

1.4.2 实验流程

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获得样品后,首先是细胞核的提取。细胞样品无需此操作,组织样品要经过研磨处理,将组织块处理成单个细胞或细胞核。随后是蛋白质和DNA的交联,使得转录因子紧密的结合在与DNA相互作用的位置,便于后续操作。紧随着是DNA片段化处理,这一步将DNA随机打断,既照顾了测序仪的读长要求,也使得测序更加精确。理想的片段长度为1-3个核小体(150-500bp)。片段化处理之后的样品,经过特异性的抗原抗体结合反应被免疫沉淀下来,而没有结合的DNA蛋白质复合体则被洗掉。
      IP下来的DNA通过连接测序接头和可以识别的条码序列,被制备成了可以用于二代测序的文库。同时片段化后的总DNA也被制备成文库,作为分析的参考。

 

二、真金炸金花游戏下载参与完成的典型案例

2.1 转录因子的ChIP-seq案例
        案例一

        EglN2 associates with the NRF1‐PGC1α complex and controls mitochondrial function in breast cancer. (EMBO J, 2016) 
       EglN2/PHD1是一个对乳腺癌发生有重要作用的氧感知器(oxygen sensor)。越来越多的研究表明在氧感知(oxygen sensing)和线粒体作用上两者有功能上配合(cross talk),并且两者在维持肿瘤生长上都有很关键的作用。这篇文章向我们展示了EglN2敲除会降低在常氧和缺氧状态下乳腺癌中线粒体的呼吸。进一步整合分析RNA-seqEglN2在缺氧状态下ChIP-seq数据 我们发现:NRF1EglN2激活的基因上有motif 富集,这暗示了NRF1可能是EglN2的共结合因子(binding partner)。进一步,我们通过ChIP-seq数据验证了 EgLN2NRF1的相互结合。机制上,通过在染色质上形成EglN2/PGC1alpha/NRF1激活复合体,EglN2激活了FDXR的转录并保持了线粒体的功能。进一步,FDXR作为EglN2的一个下游靶基因(effector),导致了乳腺癌的发生in vitro/ in vivo. 作者的发现暗示了EglN2调控了ERalpha阳性乳腺癌中线粒体的功能。

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2.1 案例实验图

 

案例二

Inactivation of PBX3 and HOXA9 by down-regulating H3K79 methylation represses NPM1-mutated leukemic cell survival (Theranostics,2018)

约1/3的急性髓系白血病(AML)患者存在NPM1 突变(NPMc+),但是,对于NPM1突变在AML发病中的分子机制尚不清楚。本研究首先分析了TCGA数据,表明在NPMc+白血病中PBX3和HOXA9存在高表达,在白血病发病过程中有重要作用。为了验证NPM1突变是否可以通过表观遗传学来调控白血病的发病进程,检测了NPMc+白血病细胞中H3K4me2、H3K9me2、H3K27me2、H3K36me2、H3K79me1、H3K79me2和H3K79me3的甲基化水平,认为H3K79的甲基化与NPMc+的转录活性有关。为了验证PBX3和HOXA9的表达是否受到H3K79甲基化的影响,通过ChIP-seq分析NPMc+ MEFs/WT和OCI-AML2/OCI-AML3的H3K79me2发现HOXA9的表达受到H3K79me2直接调控,但是PBX3没有直接作用。PBX3是HOXA的辅助因子,通过敲除HOXA9,发现PBX3的表达显著下调,但是没有影响H3K79me2,而PBX3的敲除,没有影响HOXA的表达。最后,验证DOT1L小分子抑制剂EPZ5676的作用机制,发现会引起HOXA9,PBX3 和H3K79me2的下调,诱导NPMc+白血病的自噬,DOT1L通过抑制组蛋白H3K9甲基化从而参与NPMc+白血病。

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2.1 案例实验图



2.2 组蛋白修饰的ChIP-seq案例
        Conditional Knockin of Dnmt3a R878H inituates acute myeloid leukemia with mTOR pathway involvement  (PNAS, 2018) 
      Dnmt3a是造血系统中表观遗传学的修饰基因和癌症的抑制基因。Dnmt3a 878H是急性髓样白血病(AML)中常见突变体。本研究采用条件性敲击的方法发现Dnmt3a R878H不足以引起AML。通过单细胞测序(single-cell RNA-seq)结合甲基化DNA免疫沉淀测序(MeDIP-seq)发现Dnmt3a 
R878H/WTDnmt3aWT/WT的低甲基化和超甲基化区域,通过基因注释发现不同甲基化区域(DMRs)的富集通路参与多能性干细胞和慢性粒细胞白血病(CML)调控,联合RNA-seq发现Dnmt3a R878H/WT诱导的低甲基化有助于mTOR上调。MeDIP分析显示白血病细胞的mTOR基因主体低甲基化。通过RNAi等发现mTOR的上调使CDK1的水平增加,CDK1介导EZH2的磷酸化水平增加来抑制H3K27me3的甲基化水平。通过ChIP-seq分析Dnmt3aR882H/WTDnmt3aWT/WTH3K27me3发现Dnmt3aR882H/WTH3K27me3甲基化水平和富集程度低于Dnmt3aWT/WT。明确mTOR pathway的激活作为一个疾病机制的关键调节剂并且可以通过mTOR来抑制Dnmt3a突变体相关的白血病的潜在治疗效应。

 

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2.2 案例实验图

 

三  其他应用案例

       案例一
       FAR-RED ELONGATED HYPOCOTYL3 activates SEPALLATA2 but inhibits CLAVATA3 to regulate meristem determinacy and maintenance in Arabidopsis. (PNAS, 2016)
       植物分生组织对植物组织和器官的形成是必要的。转录因子FAR-RED ELONGATED HYPOCOTYL3 (FHY3)是已知的拟南芥生长阶段发挥多重作用,但是它的功能在生殖生长期是不知道的。作者通过对fhy3突变体进行表型分析发现,FHY3在花分生组织决定和茎端分生组织的维持中都具有重要作用。通过ChIP-seqRNA-seq数据分析发现在花发育过程中有238FHY3直接结合并转录调控的靶基因(其中138个在fhy3-68突变体中是转录上调的,100个是转录下调的)。根据特异结合位点,作者发现了52个花特异的FHY3靶基因,其中63%33个基因)在fhy3-68突变体中是上调的,进一步显示FHY3在花发育中的转录抑制作用。作者进一步证实了CLV3SEP1SEP2都是FHY3的靶基因。在茎尖分生组织中,FHY3直接抑制CLV3,从而调控WUS来维持干细胞池。在花分生组织中,FHY3直接抑制CLV3,而且激活了SEP2来促进花分生组织决定。而且,作者通过遗传分析证实了两个分生组织建立和维持的关键因子WUSCLV3作用于FHY3的下游。

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3.1 案例实验图

      

        案例二    

    H2A monoubiquitination in Arabidopsis thaliana is generally independent of LHP1 and PRC2 activity. (Genome Biology, 2017)
    文章通过拟南芥H3K27me3 和H2AK121ub的ChIP-seq实验和数据,回答了一个悬而未决的植物领域表观遗传的问题,到底组蛋白修饰H2AK121ub是否需要转录因子PRC2的活性。经典模型认为,PCR2介导的H3K27me3是 招募PRC1形成H2AK121ub的不可或缺的一步,也就是说PCR2的活性是H2AK121ub形成所必须的。但是作者发现,在很多情况下,广泛存在的组蛋白修饰H2AK121ub与H3K27me3的分布无关(H3K27me3是由PCR2介导发生的)。通过一系列后续实验,作者认为在很大程度上来说 H2AK121ub的形成与PRC2的活性无关。

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3.2 案例实验图

       

        案例三      

        SETDB1 modulates PRC2 activity at developmental genes independently of H3K9 trimethylation in mouse ES cells (Genome research, 2015IF=11.3)
       小鼠胚胎干细胞中SETDB1独立调节H3K9me3过程中发育相关基因PRC2活性 
       SETDB1是一种促进H3K9 甲基化修饰的组蛋白甲基转移酶。作者首先用ChIP-seqH3K9me3做了4个重复,结合前人的SETDB1ChIP-seq 实验数据进行比对,得到了两种SETDB1peaks位点:solo peaksensemble peaksensemble peaks位点附近有H3K9me3峰值,而solo peaks附近没有。对solo peaks位点靶基因进行GO分析,发现大部分基因富集在神经发育调节功能中,而这部分基因又与核心蛋白复合体(PRC2)相互关联。PRC2结合位点附近一般伴随着丰富的H3K27me3修饰,H3K27me3修饰会抑制SETDB1修饰H3K9me3。通过SETDB1敲除,发现H3K27me3减少,神经分化得到促进。

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3.3 案例实验图